Comparación entre dos pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR satélite y PCR kinetoplasto) para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi en heces de triatominos | Comparison between two polymerase chain reaction test (satellite PCR and the kinetoplastpcr) for the detection of Trypanosoma cruzi DNA in tiratomine feces

Mariolga Berrizbeitia; Anastasis Estaba; Arleth Pozo; Alicia Jorquera; Hectorina Rodulfo

Comparación entre dos pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR satélite y PCR kinetoplasto) para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi en heces de triatominos | Comparison between two polymerase chain reaction test (satellite PCR and the kinetoplastpcr) for the detection of Trypanosoma cruzi DNA in tiratomine feces

Mariolga Berrizbeitia, Anastasis Estaba, Arleth Pozo, Alicia Jorquera, Hectorina Rodulfo

Resumen

El objetivo del presente trabajo fue modificar una prueba de reacción en cadena de la polimerasa para la detección de ADN satélite (PCRsat) de Tripanosoma cruzi en muestras de heces recolectadas sobre papel de filtro, y compararla con la detección de ADN del minicírculo del kinetoplasto (PCRk). Se clasificaron 30 triatominos con y sin infección por T. cruzi diagnosticados mediante el examen directo de las heces y luego evaluados por las pruebas moleculares. Para ello, el ADN total de las muestras de heces fue extraído empleando columnas de la casa comercial Qiagen®. Se utilizó el índice de Kappa para evaluar el acuerdo entre las pruebas. La PCRsat y la PCRk amplificaron los fragmentos específicos esperados de 168 pb y 330 pb de T. cruzi, respectivamente, en las heces de 15/15 de los triatominos clasificados como positivos. Por otra parte, los resultados demostraron que 14/15 de las muestras de heces fueron corroboradas como negativas por PCRsat y 12/15 por la PCRk. El acuerdo entre el examen directo y la PCRsat fue de 0,93 y con la PCRk de 0,80, mientras que entre las dos pruebas moleculares el índice de kappa fue de 0,73. De acuerdo con estos resultados se concluye que las pruebas moleculares proporcionan un diagnóstico confiable para la detección de ADN de T. cruzi en heces de triatominos infectados.

Palabras clave: T. cruzi, diagnóstico, TCZ3, TCZ4.

ABSTRACT

The purpose of this study was to modify a polymerase chain reaction (PCR) for the detection of satellite DNA (satPCR) of T. cruzi in stool samples collected on filter paper and to compare it with the detection of DNA from the kinetoplasto minicircle (kPCR). Thirty triatomines were classified with or without infection by direct examination of triatomine feces and then the molecular tests were performed. Total DNA from stool samples was extracted and purified using columns of Qiagen® kit. The Kappa index was used to evaluate the agreement between tests. The satPCR and kPCR amplified the expected specific fragments of 168 bp and 330 bp, respectively of T. cruzi, in the stool samples of 15/15 positive triatomines. In the other hand, no DNA was detected in 14/15 of the negative stool samples by sat PCR and 12/15 by kPCR. The agreement between direct examination and the satPCR was 0.93 and 0.80 with the kPCR, whereas between the two molecular tests it was 0.73. In conclusion, the molecular tests bring an accurate diagnostic for the detection of T. cruzi in feces of infected triatomines.

Key words: T. cruzi, diagnosis, TCZ3, TCZ4.

Referencias

ALVARADO E, MIRANDA R, RODRÍGUEZ C, VELÁSQUEZ G, LOYO J, GIL M, MOGOLLÓN N, PÉREZ M, RECCHIMUZZI G, ESPINOSA R, CARRASCO H, CONCEPCIÓN JL, BONFANTE-CABARCAS R. 2012. Electrocardiography repolarization abnormalities are characteristic signs of acute chagasic cardiomyopathy. Invest. Clin. 53(4):378-394.

BRASIL P, DE CASTRO L, HASSLOCHER A, SANGENIS L, BRAGA J. 2010. ELISA versus PCR for diagnosis of chronic Chagas disease: systematic review and meta-analysis. BMC Infect. Dis. 10:337-353.

BERRIZBEITIA M, NDAO M, GOTTSCHALK M, ACHÉ A, VÁSQUEZ F, LACOUTURE S, MEDINA M, WARD BJ. 2004. Development and comparison of an enzyme immunoassays for diagnoses of Chagas disease using fixed forms of Trypanosoma cruzi (epimastigotes, amastigotes and trypomastigotes) and assessment of antigen stability for the three assays. J. Clin. Microbiol. 42(4):1766-1769.

BRENIERE SF, BOSSENO MF, REVOLLO S, RIVERA MT, CARLIER Y, TIBAYRENC M. 1992. Direct identification of Trypanosoma cruzi natural clones in vectors and mammalian hosts by polymerase chain reaction amplification. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46(3):335-341.

ECKERT K, KUNKEL T. 1991. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Res. 1:117-124.

FELICIANGELI MD, CAMPBELL-LENDRUM D, MARTINEZ C, GONZALEZ D, COLEMAN P, DAVIES C. 2003. Chagas disease control in Venezuela: lessons for the Andean region and beyond. Trends Parasitol. 19(1):4-49.

FERRER E, DA CONCEIÇÃO F, CAMPIOLI, P, LARES M, LÓPEZ M, RIVERA M, VIETTRI M, MEDINA M, SALCEDO M, MOROCOIMA A, HERRERA L. 2008. Validación de protocolos de PCR para el diagnóstico molecular de la enfermedad de Chagas. Salus Online. 12(1):163-174.

GORDIS L. 2004. Epidemiology. Fourth edition. Saunders Elsevier. Philadelphia, USA, pp 375.

JUNQUEIRA AC, CHIARI E, WINCKER P. 1996. Comparison of the polymerase chain reaction with two classical parasitological methods for the diagnosis of Chagas disease in an endemic region of north-eastern Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 90(2):129-132.

MALDONADO E. 1998. Biología molecular en medicina. Editorial Limusa, México DF, México, pp. 200.

MOREIRA D. 1998. Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations. Nucleic Acids Res. 26:3309-3310.

MOSER DR, KIRCHHOFF LV, DONELSON JE. 1989. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27(7):1477-1482.

MULLIS KB. 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci. Am. 262(4):56-61.

NDAO M, KELLY N, NORMANDIN D, MACLEAN JD, WHITEMAN A, KOKOSKIN E, AREVALO I, WARD BJ. 2000. Trypanosoma cruzi infection of squirrel monkeys: comparison of blood smear examination, commercial enzyme-linked immunosorbent assay, and polymerase chain reaction analysis as screening tests for evaluation of monkey-related injuries. Comp. Med. 50(6):658-665.

PINTO J, NOVAES A, GONTIJO E, LUQUETTI A, SHIKANAI-YASUDA M, RODRIGUES J, DIAS JC, RAMOS AN JR, GONTIJO ED, LUQUETTI A, SHIKANAI-YASUDA MA, COURA JR, TORRES RM, MELO JR, ALMEIDA EA, OLIVEIRA W JR, SILVEIRA AC, REZENDE JM, PINTO FS, FERREIRA AW, RASSI A, FRAGATA AA, SOUSA AS, CORREIA D, JANSEN AM, ANDRADE GM, BRITTO CF, PINTO AY, RASSI A JR, CAMPOS DE, ABAD-FRANCH F, SANTOS SE, CHIARI E, HASSLOCHER-MORENO AM, MOREIRA EF, MARQUES DS, SILVA EL, MARIN-NETO JA, GALVÃO LM, XAVIER SS, VALENTE SA, CARVALHO NB, CARDOSO AV, SILVA RA, COSTA VM, VIVALDINI SM, OLIVEIRA SM, VALENTE VD, LIMA MM, ALVES RV. 2016. 2nd Brazilian Consensus on Chagas Disease. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 49(I):3-59.

PUIGBO J, GIORDANO H, SUAREZ C, ACQUATELLA H, COMBELLAS I. 1992. Actualizaciones en la enfermedad de Chagas. Buenos Aires. Buenos Aires, Organismo oficial del Congreso Nacional de Medicina.

QUEIROZ A, SANTOS P, SASSAROLI A, HÁRSI C, MONEZI T, MEHNERT D. 2001. Electropositive filter membrane as an alternative for the elimination of PCR inhibitors from sewage and water samples. Applied Environ. Microbiol. 67:4614-4618.

RAMÍREZ JD, GUHL F, UMEZAWA ES, MORILLO CA, ROSAS F, MARIN-NETO JA, RESTREPO S. 2009. Evaluation of adult chronic Chagas' heart disease diagnosis by molecular and serological methods. J. Clin. Microbiol. 47(12):3945-3951.

RUSSOMANDO G, ROJAS DE ARIAS A, ALMIRON M, FIGUEREDO A, FERREIRA ME, MORITA K. 1996. Trypanosoma cruzi: polymerase chain reaction-based detection in dried feces of Triatoma infestans. Exp. Parasitol. 83(1):62-66.

SCHIJMAN AG, BISIO M, ORELLANA L, SUED M, DUFFY T, MEJIA JARAMILLO AM, CURA C, AUTER F, VERON V, QVARNSTROM Y, DEBORGGRAEVE S, HIJAR G, ZULANTAY I, LUCERO RH, VELAZQUEZ E, TELLEZ T, SANCHEZ LEON Z, GALVÃO L, NOLDER D, MONJE RUMI M, LEVI JE, RAMIREZ JD, ZORRILLA P, FLORES M, JERCIC MI, CRISANTE G, AÑEZ N, DE CASTRO AM, GONZALEZ CI, ACOSTA VIANA K, YACHELINI P, TORRICO F, ROBELLO C, DIOSQUE P, TRIANA CHAVEZ O, AZNAR C, RUSSOMANDO G, BÜSCHER P, ASSAL A, GUHL F, SOSA ESTANI S, DASILVA A, BRITTO C, LUQUETTI A, LADZINS J. 2011. International study to evaluate PCR methods for detection of Trypanosoma cruzi DNA in blood samples from Chagas disease patients. PLoS Negl. Trop. Dis. 5(1):e931.

WINCKER P, BRITTO C, PEREIRA JB, CARDOSO MA, OELEMANN W, MOREL CM. 1994. Use of a simplified polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples from chronic chagasic patients in a rural endemic area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 51(6):771-777.

WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). 2015. Chagas disease in Latin America: an epidemiological update based on 2010 estimates. Wkly Epidemiol Rec. 90:33-43.

ZELEDON R, RABINOVICH JE. 1981. Chagas' disease: an ecological appraisal with special emphasis on its insect vectors. Annu. Rev. Entomol. 26:101-133.